I modelli di cancro disponibili sono focalizzati su diversi aspetti farmacologici delle risposte tumorali a nuovi farmaci antitumorali. La nostra competenza specifica è incentrata sulla biologia molecolare e cellulare, test in vitro/in vivo su modelli xenograft murini e umani. Sono disponibili più di 70 modelli xenograft sottocutanei, ortotopici e metastatici per la valutazione efficace di nuovi composti. Il nostro portfolio di modelli xenograft per tumori umani include linee cellulari cancerose dai seguenti tessuti: cervello, mammella, sistema nervoso centrale, colon, rene, sistema ematopoietico, polmoni, ovaie, pancreas, prostata, pelle e stomaco. Tutte le attività sperimentali sono sottoposte a controlli di qualità, applicando le procedure previste dagli standard GLP.

Valutazione di tumori con imaging bioluminescente quantitativo: la disponibilità di un grande numero di modelli preclinici bioluminescenti permette la valutazione della progressione tumorale in real time, utilizzando il sistema di imaging ottico IVIS Spectrum della PerkinElmer. Modelli umanizzati: disponiamo di un gran numero di tumori primari (biopsie derivanti da pazienti) trapiantati in topi con tumore ( cancro al polmone, mesotelioma e altri).

Valutazione di farmaci anticancro: somministrazione di candidati terapeutici attraverso differenti modalità (intravenosa, orale/gavage, intramuscolare, intratracheale, con device che permettono il rilascio lento), da soli o combinati con farmaci antitumorali tradizionali, con alto standard di sicurezza.

Fertilizzazione di un gran numero di ovociti (fino a 200) di topo utilizzando sperma congelato o fresco. Questa procedura è particolarmente adatta per una rapida espansione di una colonia murina con pochi maschi o per recuperare una colonia i cui maschi fossero non fertili dopo ripetuti accoppiamenti naturali senza successo. Lo stesso protocollo è utilizzato per le colonie crioconservate tramite congelamento dello sperma.  

Fertilizzazione di un gran numero di ovociti (fino a 200) di topo utilizzando sperma congelato o fresco. Questa procedura è particolarmente adatta per una rapida espansione di una colonia murina con pochi maschi o per recuperare una colonia i cui maschi fossero non fertili dopo ripetuti accoppiamenti naturali senza successo. Lo stesso protocollo è utilizzato per le colonie crioconservate tramite congelamento dello sperma.  

Glaucoma
L’aumento della pressione intraoculare (Intra Ocular Pressure -IOP-) causa un danno alla retina e al nervo oftalmico che non può essere riparato con le attuali terapie. Sono pertanto ancora necessari test di nuovi approcci terapeutici su modelli sperimentali, con un aumento ripetibile della IOP. L’IOP in modelli sperimentali di glaucoma offre la possibilità di testare l’efficacia di nuovi composti in un sistema controllato e affidabile. Grazie all’attrezzatura avanzata e allo staff esperto, lo stabulario può offrire modelli altamente controllati di glaucoma sperimentale in ratti e topi. Il danno alla retina è valutato e quantificato utilizzando parametri standard, come la valutazione istologica delle cellule del ganglio retinico e la perdita o la modulazione di specifici marcatori di sopravvivenza cellulare o di morte cellulare.

Neuropatia ottica anteriore ischemica non-arteritica (Nonarteritic Anterior Ischemic Optic Neuropathy -NAION) Lo stabulario offre un modello di ratto di NAION completamente studiato, ottenuto tramite l’attivazione con laser di un colorante intravascolare, con conseguente stress endoteliale e danni ai vasi. La lesione indotta al nervo ottico anteriore è indistinguibile da quelle osservate in clinica, rendendo questo modello uno strumento insostituibile per la valutazione di efficacia di nuovi candidati farmacologici. La valutazione istologica standard utilizzata per definire e quantificare la gravità della neuropatia si affianca alla misurazione del flusso sanguigno a livello del nervo ottico attraverso l’utilizzo di un sistema di imaging Photo-acoustic Laser Doppler (VEVO 2100, Visualsonics). Come tutti i modelli forniti da Biogem Service, gli studi di efficacia possono essere modulati secondo specifiche richieste.

Retinite pigmentosa
La retinite pigmentosa è la causa più comune di degenerazione retinica. Il danno alla vista è innanzitutto dovuto alla perdita di fotoricettori, che conduce al conseguente danno dell’epitelio pigmentato retinico e di altri strati della retina. I cambiamenti nella vascolarizzazione retinica sono importanti proprietà cliniche, con l’attenuazione dei vasi retinici nelle fasi iniziali e degenerazione fibrotica negli stadi successivi della malattia. Lo stabulario offre un modello animale specifico per questa malattia rappresentato dai ratti RCS/Kyo ( Royal College of Surgeons) () con degenerazione retinica ereditata. Il difetto genetico nel gene mertk causa l’incapacità delle cellule dell’epitelio retinico  a riciclare i segmenti esterni dei fotorecettori.

Occhio secco (Cheratocongiuntivite sicca, KCS)

Modelli di malattie infiammatorie intestinali (Inflammatory bowel diseases IBD):colite ulcerosa, morbo di Crohn
Le malattie infiammatorie intestinali sono malattie infiammatorie croniche che comprendono la Colite Ulcerosa e il morbo di Crohn, mediate da fattori genetici, immunitari e ambientali. L’approccio terapeutico non è ancora ben definito, e numerosi nuovi farmaci candidati devono essere sviluppati. Modelli animali di malattie infiammatorie intestinali chimicamente indotte, disponibili dal Biogem Service, possono essere utilizzati per analizzare il meccanismo di azione e sviluppare nuove strategie terapeutiche. 

NEFROPATIA DIABETICA

La DN è una malattia renale progressiva causata da un diabete mellito (DM) di lunga durata ed è una delle complicazioni più comuni di questa malattia. E’ inoltre una delle prime cause di dialisi in molti Paesi sviluppati. Nonostante la DN sia una patologia ben conosciuta, i trattamenti attualmente disponibili ne possono solo rallentare il decorso. Sono pertanto necessari nuovi farmaci candidati, soprattutto per bloccare i sintomi della DN.

Artrite reumatoide

RA è un disordine autoimmune di lungo termine che interessa innanzitutto le articolazioni, e si suppone sia causato da fattori genetici e ambientali. Colpisce da 5 a 50 persone su 100.000 ogni anno. Il meccanismo patologico alla base della RA è rappresentato da una grave reazione autoimmune contro le articolazioni. L’approccio terapeutico principale è sintomatico, con l’obiettivo di ridurre il dolore e l’infiammazione. Analgesici, steoridi, FANS e farmaci antireumatici che modificano la malattia sono i rimedi più frequentemente utlizzati. Con la speranza di favorire la scoperta di nuovi approcci farmaceutici per il trattamento dell’artrite reumatoide, nel nostro stabulario viene attualmente utilizzato un modello altamente riproducibile di RA, ottenuto tramite inocuazione in topi DBA1/J di Collagene II. Questo trattamento causa un grave gonfiore delle articolazioni tarsali e un arrossamento a partire da due settimane dopo la seconda inoculazione.

Cistite

 La cistite è una patologia infiammatoria comune che coinvolge la vescica urinaria, e che ha un’incidenza dal 6.2% all’11.2% nelle donne e dal 2.3% al 4.6% negli uomini. È spesso causata da un’infezione del tratto urinario inferiore da E. coli, e rappresenta l’infezione batterica più frequente nelle donne. Con l’obiettivo di aiutare i ricercatori nella scoperta di nuovi approcci terapeutici alla cistite, nel nostro stabulario è disponibile un modello in vivo acuto di questa patologia, ottenuto attraverso iniezione intraperitoneale di Ciclofosfamide in ratti femmina Sprague-Dawley. Offriamo, inoltre, la possibilità di seguire lo sviluppo della cistite attraverso imaging ecografico utilizzando la VEVO 2100, attrezzata con LAZR (Visualsonics). 

Diabete mellito di tipo I e II (DM)
Con il termine di Diabete Mellito (DM) si intende un gruppo di patologie metaboliche caratterizzate da alti livelli di glucosio nel sangue per un lungo periodo. La loro incidenza sta aumentando nel mondo a un ritmo allarmante. Due sono le patologie fondamentali : diabete Tipo I (Insulin-Dependent Diabetes Mellitus – IDDM) e diabete Tipo II (Non Insulin-Dependent DM – NIDDM). Il tipo II rappresenta il 90-95% di tutti i diabeti. Biogem Service offre un ampio campione di modelli genetici e indotti di diabete mellito per favorire la scoperta di nuove strategie terapeutiche e per affrontare le complicazioni legate a queste patologie metaboliche.

I topi NOD rappresentano il modello spontaneo principale per IDDM: nei topi NOD, soprattutto femmine, gli eventi patologici iniziano a svilupparsi dalla terza settimana d’età, con l’attivazione linfocitaria verso gli antigeni delle insule pancreatiche, che conduce a insulite entro 15 settimane. Questi eventi innescano una forte risposta autoimmune contro le insule pancreatiche, la quale conduce a un diabete conclamato (glicemia a digiuno ≥ 250 mg/dL) tra 18 e 20 settimane d’età. • Modelli indotti da streptozotocina (STZ) Le iniezioni singole o multiple di STZ in topi o ratti rappresentano un modello sperimentale indotto largamente utilizzato per IDDM. In questo modello, DM è indotto in ratti o topi attraverso iniezioni intraperitoneali singole o multiple di STZ dissolta in tampone citrato. STZ è un agente citotossico molto selettivo per cellule β pancreatiche e conduce alla distruzione delle insule pancreatiche e allo sviluppo di DM entro 48 ore, con glicemia a digiuno di oltre 500 mg/dL.

Iniezioni singole o multiple di STZ in topi o ratti rappresenta un modello sperimentale indotto largamente utilizzato per IDDM: in questo modello, DM è indotto in ratti o topi attraverso iniezioni intraperitoneali singole o multiple di STZ dissolta in tampone citrato. STZ è un agente citotossico molto selettivo per cellule β pancreatiche, e che conduce alla distruzione delle insule pancreatiche e   allo sviluppo di DM entro 48 ore, con glicemia a digiuno di oltre  500 mg/dL.

Animali DIO rappresentano un modello indotto molto utile per studiare NIDDM, obesità e ipercolesterolemia. Nel nostro stabulario, topi maschi C57 BL/6 o ratti Sprague-Dawley sono nutriti per 4-8 settimane con una dieta altamente calorica, (contenente più del 60% di grasso) che porta a obesità, NIDDM indotto da obesità e ipercolesterolemia.

I modelli murini geneticamente modificati sono uno degli strumenti più potenti in diversi campi della scienza, come cancro, immunotossicità indotta da farmaci e biologia dello sviluppo. Topi geneticamente modificati sono sviluppati per modellare in modo più preciso fenotipi e patologie umane, dando ai ricercatori un modo migliore per esplorare meccanismi patologici e scoprire nuovi farmaci. Attualmente è possibile rimuovere, ricollocare e inserire ogni tipo di sequenza nel genoma murino. Biogem offre una generazione personalizzata di qualità di modelli murini, utilizzando diverse tecniche, inclusa la ricombinazione omologa in cellule staminali embrionali (ES), tecnica CRISPR/Cas9 e una serie di tecnologie avanzate di biologia molecolare, permettendo di ottenere i modelli specifici di cui si ha bisogno.

Lista dei servizi

• Progettazione di una strategia mirata
• Costruzione di un vettore mirato
• Strategia con sistema CRISPR/Cas9
• Elettroporazione di cellule staminali embrionali (ES) di topo
• Valutazione di cellule ES per ricombinazione omologa
• Generazione di topi chimerici mediante iniezione di morula o blastocisti
• Valutazione della trasmissione germinale
• Allevamento di topi chimerici per eterozigosità

I nostri servizi possono essere commissionati tutti insieme o individualmente, in base ai bisogni del ricercatore. Possiamo inoltre generare delle chimere anche attraverso microiniezioni di cloni di ES, ottenuti da consorzi come KOMP a EUCOMM.

Tipi di modelli murini:

Knock out costitutivo
Un knock out costitutivo eliminerà la funzione del gene bersaglio in tutte le cellule, attraverso lo sviluppo e l’età adulta. Il knock out tradizionale include la delezione o la inattivazione di entrambe le copie di un gene specifico. È indicato per studiare la funzione genetica, lo sviluppo di farmaci e terapie, e la ricerca su malattie.

Knock out condizionale
Un knock out condizionale comprende la delezione o la inattivazione di un gene solo in un particolare organo, tessuto o tipo cellulare o soltanto durante una certa fase di sviluppo. Questo sistema utilizza il sistema Cre-Lox. Questa è una DNA ricombinasi sito-specifica che permette l’inattivazione del gene di interesse attraverso l'interazione tra l'enzima ricombinasi Cre e i siti loxP nella sequenza del DNA (un topo nel cui DNA sono inseriti i siti ricombinasi-specifici viene incrociato con un altro topo che esprime la ricombinasi). L’espressione tessuto-specifica della ricombinasi permette la inattivazione del gene di interesse solo nel tessuto in cui si esprime la ricombinasi stessa. Questa tecnica condizionale offre la possibilità di un knock out controllato temporalmente e spazialmente e nello stesso tempo permette al modello murino di svilupparsi normalmente sotto il controllo del gene di interesse, fin quando esso è attivo.

Mutazione puntiforme costitutiva/condizionale
Questo approccio comprende l’introduzione di uno o più mutazioni puntiformi in un punto qualsiasi del gene bersaglio, per analizzare l’effetto degli SNP. Questo metodo può essere anche combinato con approcci tradizionali, fornendo una mutazione genetica controllata in modo, tempo, e tessuto-specifici.

Knock in Rosa26
Questo approccio, chiamato “knock in”, è basato sull’inserzione del transgene in un punto ben caratterizzato e trascrizionalmente attivo del genoma murino, come il locus ROSA26, con molteplici vantaggi rispetto all’approccio con iniezione nel pronucleo.

Umanizzazione
L’umanizzazione, basata sull’approccio knock in, permette di testare in vivo composti e anticorpi verso proteine umane nel topo. Questo è ottenuto tramite la sostituzione del gene murino con la controparte umana, inserendo il gene nello stesso contesto trascrizionale del gene murino.

Reporter con geni chimerici
L’utilizzo di vettori targeting permette l’introduzione di un gene reporter per seguire l’espressione genica.

Ceppi di topo costitutivo/inducibile Cre- o FLP-diver
Gli approcci condizionali basati sul sistema Cre/lox richiedono ceppi murini che esprimano la ricombinasi in un modo, tessuto,- e tempo-specifici. Per sviluppare questi modelli è necessaria la generazione di topi che esprimano ricombinasi Cre (costitutiva o inducibile) sotto il controllo di un promotore specifico.

Altri servizi:
Assistenza nel preparare richieste di autorizzazione ministeriale
Genotipizzazione
Modificazione in vivo Cre o FLP
Caratterizzazione fenotipica di modelli murini
Raccolta di campioni murini
Crioconservazione di sperma
Fecondazione in vivo (IVF)
Riderivazione di topi in SPF

Nel campo della biologia dello sviluppo dei vertebrati e della genomica funzionale, lo studio degli embrioni di zebrafish è stato facilitato poiché essi sono trasparenti e questo ha permesso ai ricercatori di seguire in tempo reale e in vivo vari fenomeni della regolazione genica, utilizzando geni chimerici fluorescenti. Conseguentemente, il trasferimento delle informazioni genetiche e biologiche dal pesce all’uomo è stata più veloce che in altri sistemi di vertebrati.

La facility zebrafish di Biogem è attrezzata con sistemi di allevamento oltreché di tossicologia sperimentale. I sistemi di allevamento hanno una circolazione continua di acqua con valori di temperatura (°C), conduttività (μS) e pH costantemente controllati, al fine di garantire le migliori condizioni per lo sviluppo dei pesci. I sistemi di tossicologia, diversamente da quelli di allevamento, non hanno nessun riciclo continuo di acqua. I valori di temperatura (° C), conduttività (μS) e pH dell’acqua sono costantemente controllati ed è possibile programmare cambi di acqua a specifici intervalli di tempo, al fine di ottimizzare la concentrazione delle molecole e dei farmaci da testare.

Il servizio zebrafish offre expertise per linee transgeniche e generazione di mutanti e supporto per la progettazione e la realizzazione di studi tossicologici con i modelli zebrafish